据中国激光杂志社网，于2025年02月23日报道，双光子显微镜（Two-photon microscopy，TPM）凭借其内在的光学切片能力，对体内荧光成像技术产生了革命性的影响。然而，这种光学切片能力不足以完全避免目标结构之间的信号串扰，导致信号混合，从而降低图像对比度，并加大了神经功能响应解读的复杂性。缓解这一问题的策略包括自适应光学、结构化照明以及计算校正等方法，但这些方法在实际应用中面临诸多挑战，例如系统复杂性、有限的视场范围、时间非平稳性以及对像差的高敏感性。随着样品标记密度的增加，这些问题在高标记密度条件下被进一步放大。
超声（Ultrasound，US）波的声光调制（Acousto-optic modulation，AOM）已被证明能够通过聚焦或时间门控的超声场对相干光进行局部调制，从而提高散射组织内部或透过散射组织的光学成像分辨率和深度选择性。声光调制还被应用于高分辨率荧光成像，其中利用调制的“引导星”实现散射介质中的聚焦。此外，声光调制信号还可用于荧光目标在散射介质中的低分辨率成像。超声压力波可引起折射率的调制、散射中心的周期性运动以及荧光分子浓度在超声频率下的调制。然而，荧光调制的关键或主要机制尚不清晰。目前，这些声光调制方法通常产生较低的调制比，即信号的调制分量与非调制分量之比（参见方法），通常低于1%。
美国纽约大学的Shy Shoham教授团队报道了一种新型的强双光子激发荧光声光调制现象。利用这一效应，可显著增强图像细节与对比度，并改善体内深层脑组织的光学切片能力。且此种强双光子激发的超声调制辅助多光子成像方法与常规多光子显微镜兼容，无需对光路或图像采集参数进行修改即可实现应用。该研究以“Ultrasound–Modulation Assisted Multiphoton Imaging”为题，发表在Advanced Photonics 2024年第6期。
研究内容
声光调制的观测
在光路中引入环形超声换能器，可以对常规双光子显微镜收集的荧光信号实现声光调制（图1a）。超声焦点与光学扫描体积共定位，并通过将换能器耦合至物镜，使两者的焦点在不同平面聚焦时保持同步移动。双光子显微镜的视场被限制在超声焦点范围内，通过光栅扫描采集空间荧光强度图像，像素采集速率约为超声周期的20倍（图1b）。
荧光微球簇成像过程中，在传输连续波（CW）超声束的条件下，观察到了显著的荧光调制现象（图2a，左上）。在图像的单线扫描中，荧光信号在超声传输期间相较于未调制水平下降幅度可达50%。这一声光调制效应在原始光栅扫描图像中呈现为可见的高对比度“条纹”（图2a）。
研究团队进一步表征了该效应对超声压力和激光强度的影响。在超声频率下，调制比通常不受激光强度引起的荧光信号变化影响，但随声压的增加大致呈线性增长（图2c和2d），这一趋势与先前关于单光子荧光声光调制的研究结果相类似。值得注意的是，实验结果表明二次谐波声光调制信号则与声压呈二次方关系。在声光调制荧光研究中，研究团队实现了在体内对表达eGFP的神经元进行成像时，观察到了强烈的荧光调制现象，且所需超声压力较低（<500 kPa），其对压力和激光强度的影响与之前的观察结果相似（图2e和2f）。
调制图像的提取
研究团队探讨了利用观察到的显著声光调制效应来显著提升超声调制辅助多光子成像对双光子显微镜图像质量的增强效果。为此，研究团队开发了一种基于频域滤波光栅扫描线的处理方法，用于提取图像的调制成分（图3a）。该解调信号显著提高了图像的对比度（特征与背景的比值）。在体内表达eGFP的神经元的单帧解调图像中，这种增强效果表现为显著的对比度提升（图3a，左下），并且在较低帧率和较高超声压力下观察到信噪比（SNR）的提升（图3a，右下）。在微球成像实验中，解调过程显示调制信号在边缘区域最为显著，进一步表明超声调制辅助多光子成像对图像边缘特征的增强效果（图3b）。
体内成像增强
研究团队生成了高密度标记脑组织中表达eGFP和GCaMP6s神经元的三维图像堆栈。解调后的图像显示出更强的离焦抑制效果和更高的对比度（图4a，左）。值得注意的是，解调图像在细节呈现上显著提升，能够更清晰地分辨图像中的结构特征。通过对未调制与解调图像中神经元特征的线剖面进行比较，研究人员量化分析了图像对比度的增强效果（图5b）。结果表明，图像在神经元边界处的对比度显著提升。此外，超声调制辅助多光子成像能够在不影响成像帧率的情况下生成高对比度的图像特征，从而消除先前因均匀背景信号导致的模糊效果。
结论与展望
该研究揭示了一种强大的新型声光调制形式，能够显著提升体内多光子显微成像的图像质量。例如，通过增强边界细节，超声调制辅助多光子成像有望解决区分神经网络和胞体钙信号贡献这一技术难题。凭借硬件设计和计算处理的简单性，超声调制辅助多光子成像有望在散射组织中荧光物质的结构和功能研究中得到广泛应用。
期刊简介Advanced Photonics （AP）创刊于2019年，是一本重点关注新兴光学领域的基础与应用研究成果、聚焦最新及快速发展的光学与光子学学科的国际OA期刊。期刊入选中国科协高起点新刊计划，2021年被SCI收录，最新影响因子20.6，在全球JCR光学期刊中位列第4（Q1区），中国科学院一区，入选中国科技期刊卓越行动计划二期。创刊以来AP发表了众多国际顶尖学者的高水平学术论文，并以采访、新闻、评论等丰富的形式，展现了光学与光子学领域的最新进展。姊妹刊Advanced Photonics Nexus（APN）接收AP的快速转投和自然来稿，致力于成为既发表基础研究类又发表工程应用类文章的综合性大刊，2024年入选中国科协高起点新刊计划。
